Hirslanden Precise Labor

NGS, auch als Hochdurchsatz-Sequenzierung bekannt, ist eine Methode zur schnellen und parallelen Sequenzierung von DNA. Sie ermöglicht die Sequenzierung großer Mengen an DNA in kurzer Zeit. NGS hat die traditionelle Sanger-Sequenzierung weitgehend abgelöst und wird in vielen Bereichen der Genomik angewendet, wie zum Beispiel bei der Entschlüsselung von Genomen, der Aufklärung genetischer Variationen oder bei der Untersuchung von Krankheitserregern. Bei der Hirslanden Precise wird das Sequencing by Synthesis (SBS), eine Technologie, die von Illumina für die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) entwickelt wurde eingesetzt. Hauptsächlich setzen wir das Sequencing by Synthesis zur Entschlüsselung des gesamten Exoms (Proteinkodierender Anteil des Erbgutes) ein. Zusätzlich wird das mitochondriale Genom parallel sequenziert, welches Aufschlüsse über mögliche Mitochondriopathien gibt. Die Verteilung von möglichen mitochondrialen Varianten und des Wildtyps (Heteroplasmie) wird hierbei auch bestimmt.

Die in der Whole Exome Analyse (Whole Exome Sequencing; WES) eingesetzte DNA gewinnen wir in der Regel aus EDTA Blut. Zusätzlich zu der WES Analyse können wir Varianten, welche nur in bestimmten Geweben vorkommen und nicht in der gesamten Keimbahn analysieren und quantifizieren (Mosaizismus). Beispiel hierfür sind Varianten, verantwortlich für vaskuläre Malformationen, welche in Biopsien des betroffenen Gewebes nachgewiesen werden. 

Die Sanger-Sequenzierung, benannt nach dem britischen Biochemiker Frederick Sanger, ist eine von ihm entwickelte Methode zur Bestimmung der DNA-Sequenz. Sie basiert auf der Verwendung von DNA-Polymerasen, welche die DNA kopieren und dabei spezielle modifizierte Nukleotide einbauen. Bei Sanger-Sequenzierung wird die DNA in Einzelstränge aufgetrennt und mit Hilfe von markierten Nukleotiden, die bestimmte Basen repräsentieren, sequenziert. Die fragmentierte DNA wird dann durch Elektrophorese getrennt und die resultierenden Fragmente geben Aufschluss über die DNA-Sequenz.

Die Sanger Sequenzierung wird bei der Hirslanden Precise zum Nachweis bzw. Ausschluss von familiär bekannten Varianten genutzt, bei welchen nur ein kurzer Bereich des menschlichen Genoms kontrolliert werden muss. Andererseits zur Bestätigung pathogener Varianten, welche im NGS eruiert wurden, oder bei Bedarf zur Ergänzung nicht genügend durch NGS abgedeckter Einzelgen-Bereiche und seltener auch zur Analyse einzelner kleiner Gene bei spezifischer Fragestellung.

MLPA ist eine Methode zur Detektion von Kopienzahlvarianten in der DNA. Sie beruht auf der Verwendung von spezifischen Sonden, die an spezifische Genorte binden können. Durch Ligation der Sonden an die Zielregionen und anschließende PCR-Amplifikation kann die Anzahl der spezifischen DNA Sequenzen bestimmt werden. MLPA wird häufig verwendet, um Deletionen oder Duplikationen in bestimmten Genen oder Genomregionen zu identifizieren, welche mit genetischen Erkrankungen assoziiert sind.

MS-MLPA wird zur Untersuchung von DNA-Methylierungsänderungen, in den durch die Sonden-Mixe definierten Genen, eingesetzt. Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die das Genexpressionsmuster beeinflusst. MS-MLPA ermöglicht die schnelle und parallele Detektion von Methylierungsänderungen in mehreren Zielsequenzen. Durch Verwendung verschiedener DNA-Sonden kann MS-MLPA spezifische Methylierungsmuster in verschiedenen Genomregionen identifizieren. 

Grundlage einer Fragmentlängenanalyse, d.h. einer Bestimmung der Grösse eines PCR-Produkts, ist eine sogenannte Endpunkt-PCR. Durch die Verwendung eines fluorophor-markierten Primers trägt je ein Strang der entstehenden PCR-Produkte am Ende einen Fluoreszenzfarbstoff (labeling). Mittels hochauflösender Kapillarelektrophorese und einer spezifischen Software kann die Länge der PCR-Fragmente auf das Nukleotid genau bestimmt werden.

Diese Methode kommt vor allem bei Triplett-Repeat-Expansions-Erkrankungen, wie fragile X (FMR1-Gen, spinozerebelläre Ataxien etc.), zum Einsatz. Die Methode kann aber auch zum Nachweis spezifischer Punktmutationen in einem Gen eingesetzt werden indem die Primer so generiert werden, dass die entstehenden Fragmentlängen mutationsspezifisch variieren wie z.B. bei der Analyse bezüglich der 50 häufigsten CFTR-Mutationen, die mit cystischer Fibrose (CF) einhergehen.